Fuzzy C Means(FCM)是一種無監(jiān)督學習算法，用于將數(shù)據(jù)點分配到多個簇中。與傳統(tǒng)的K-means聚類不同，F(xiàn)CM允許每個數(shù)據(jù)點屬于多個簇，并為每個數(shù)據(jù)點分配一個隸屬度，表示該點屬于某個簇的程度。作者通過將Fuzzy C Means和WGCNA結合找出糖尿病腎病的生物標志物，且該生物標志物可以展示疾病的進展，一起來看看吧~

題目：通過定量蛋白質組學研究HMGB1作為早期糖尿病腎病監(jiān)測的潛在血清生物標志物

雜志：iScience

影響因子：IF=4.6

發(fā)表時間：2024.01.08

糖尿病(DM)是一種慢性代謝性疾病，其特征是胰島素分泌或利用受損導致的慢性高血糖。全球有超過4.15億人患有糖尿病，預計到2045年將有6.93億人被診斷出患有糖尿病。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，大約30%–40%的糖尿病患者會發(fā)展為DN。不幸的是，大多數(shù)DN患者在沒有任何癥狀的情況下進展，直到出現(xiàn)腎損傷，然后發(fā)生不可逆的腎衰竭，只能通過腎移植和透析來治療。DN不僅對患者的生命構成威脅，還給患者和社會帶來巨大的經濟和醫(yī)療負擔。因此，早期診斷是有效預防和治療DN的關鍵。

然而，基于質譜(MS)的蛋白質組學是分析蛋白質以發(fā)現(xiàn)潛在疾病相關生物標志物的首選技術。血清中含有大量分泌蛋白，這些蛋白在生理和病理變化中起著至關重要的作用。因此，全面的血清蛋白質組學可用于發(fā)現(xiàn)DN的新型蛋白質生物標志物，從而了解更多有關病理生理學的信息并提高診斷分層的準確性。盡管有許多研究探索血清蛋白質組學以尋找潛在的DN生物標志物，但由于方法限制，只能檢測到有限數(shù)量的蛋白質。最近已經開展了涉及血清蛋白質組學以研究DN進展的研究，但它們無法區(qū)分DM和早期DN。此外，許多研究僅關注血清中的生物標志物，而很少有研究檢查通過體外、細胞或動物模型鑒定的分子。因此，需要進一步探索基于血清蛋白質組學的DN進展生物標志物。

作者使用健康對照(NC)、糖尿病患者(DM)、早中期DN(DN-EM)和晚期DN(DN-L)的血清樣本，采用定量蛋白質組學和Mfuzz聚類分析，發(fā)現(xiàn)15種蛋白質在DN進展過程中表達增加，暗示它們具有生物標志物的潛力。隨后，將Mfuzz聚類與加權基因共表達網絡分析(WGCNA)相結合，篩選出了五個候選蛋白，并在小鼠中進行了實驗驗證。

共招募了96名健康對照、糖尿病和糖尿病腎病參與者，通過納排標準得出24名受試者，進一步將其分為四組，包括健康對照(NC)、糖尿病(DM)、早中期(DN-EM)和晚期(DN-L)，每組6名進行液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析。

作者共招募了96名受試者，在入組進行血清蛋白質組學分析時，他們的納入和排除標準被重新設定，因此最終入組24名，按照全球腎臟病預后改善組織(KDIGO)對慢性腎臟病(CKD)eGFR的分類，他們進一步分為4組(圖1A)，每組6例。受試者的人口統(tǒng)計學和臨床特征列于表1。

隨后，用LC/MS鑒定出1602種蛋白質，其中1402種蛋白質可以定量（圖1B）。與基于酶水解和質譜碎裂模式的一般規(guī)律一致，大多數(shù)肽段分布在7–20個氨基酸內，這表明質譜鑒定的肽長度分布符合質量控制標準（圖1C）。為了確保血清樣本和檢測技術的可靠性，并確認定量結果的統(tǒng)計一致性，我們采用了一種綜合方法，包括皮爾遜相關系數(shù)(PCC)、主成分分析(PCA)和相對標準偏差(RSD)評估。PCC分析顯示所有標本之間存在高度相關性，相關系數(shù)普遍高于0.9（圖1D）。PCA分析表明這些蛋白質可以成功區(qū)分這四個組（圖1E）。值得強調的是，與其他階段相比，DN-EM和DN-L組表現(xiàn)出最明顯的差異。這表明在DN階段蛋白質表達譜發(fā)生了顯著改變。每組蛋白質的定量重復性都是可以接受的，如RSD箱線圖所示（圖1F）。

作者對血清蛋白質組學定量結果進行差異表達蛋白分析（p<0.05、FC>1.5和FC<1/1.5）。經過預處理和缺失值過濾后，熱圖共顯示484個差異蛋白（圖2A）。此外，還分析了NC，DM，DN-EM和DN-L組之間成對比較的火山圖，以可視化差異表達蛋白（圖2B-2G）。在組間成對比較的背景下，兩個DN組與NCvs.DM組相比具有更多差異表達蛋白，并且與DN-EM和DN-L相比，NC組的差異表達蛋白最多（圖2H）。然后，從組間成對比較中選出所有差異表達蛋白，并繪制了它們的UpSet圖，結果顯示，在DN-EM與NC、DN-L與NC、DN-EM與DM和DN-L與DM中存在40種常見上調蛋白和23種常見下調蛋白（圖2I和2J）。

利用血清蛋白質組學，作者執(zhí)行了fuzzy c-means算法對潛在蛋白質進行聚類。總共觀察到代表不同調控蛋白的5個時間模式簇（圖3）。在這些簇中，簇1代表下調蛋白質，簇2和5代表上調蛋白質，簇3和4代表雙峰表達蛋白質。在本研究中，重點關注在DN進展過程中升高的蛋白質，即簇2和5。隨后，對每個簇中蛋白質進行GO分析，結果顯示上調的蛋白質傾向于執(zhí)行多種功能，包括細胞外基質(ECM)結構成分、細胞粘附分子結合、ECM、內質網腔和生物粘附（簇2）。Cluster2中蛋白質的KEGG通路主要富集在蛋白質的消化和吸收、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、ECM-受體相互作用以及內質網中的蛋白質加工（圖3）。

為了獲得可靠的DN診斷指標，作者設置了聚類成員資格、組內的RSD和聚cluster2中獨特肽的數(shù)量?？偣灿?6條肽符合條件，源自15種不同的蛋白質，包括ADAMDEC1、ADAMTSL4、AMBP、APOA4、AZGP1、CD44、COL18A1、COL6A3、EEA1、FBLN1、FBN1、HMGB1、MAN1A1、OAF和PTPRG（表S3）。比較了所有四個組中每種肽的表達水平（圖4A），F(xiàn)BLN1、AZGP1、CD44、ADAMDEC1、ADAMTSL4和HMGB1組顯示出顯著差異（p<0.001）。為了探究DN進展的機制，將15種蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫，上傳至Cytoscape，構建PPI網絡數(shù)據(jù)，使用Cytohubba插件按degree降序篩選出前21個核心蛋白（圖4B）。根據(jù)最高分值，CD44、HMGB1和AMBP可能在DN進展中起關鍵作用。隨后對這15種蛋白進行GO和KEGG富集分析，其功能主要與ECM結構和受體相互作用有關，ECM沉積在DN發(fā)展中起重要作用（圖4C）。

使用WGCNA方法對所有蛋白質進行共表達網絡分析，得到五個不同顏色的不同模塊(圖5A)。使用具有各種模塊分配和蛋白質樹狀圖的熱圖對DN蛋白質的拓撲重疊矩陣(TOM)進行初始可視化(圖5B)。在此基礎上，研究了模塊特征基因與性狀DN之間的模塊-性狀關系，DN組包含來自DM、DN-EM和DN-L組的所有蛋白質（圖5C）。有趣的是，只有藍色模塊與性狀NC（cor=0.51和p=0.01）和DN（cor=0.45和p=0.03）均最顯著相關。最后，用維恩圖探索了藍色模塊和聚類2中蛋白質的重疊（圖5D，表2）。

研究表明HMGB1與DN的發(fā)展之間存在顯著聯(lián)系。基于ROC曲線分析，作者發(fā)現(xiàn)HMGB1是區(qū)分DN-EM與NC(ROC的AUC=0.917)、DN-L與NC(ROC的AUC=1.000)、DN-EM與DM(ROC的AUC=0.889)和DN-L與DM(ROC的AUC=1.000)的良好標記(圖6A)。此外，HMGB1與eGFR（Pearson R=?0.787和p<0.001）、血尿素氮、血清肌酐比率（Pearson R=?0.631和p<0.001）呈負相關。同時，HMGB1與血尿素氮（Pearson R=0.646和p<0.001）、血清肌酐（Pearson R=0.688和p<0.001）和胱抑素c（Pearson R=0.661和p<0.001）呈正相關（圖6B-6F）。這些研究結果表明，HMGB1可以準確監(jiān)測疾病的狀態(tài)，尤其是對于DN早期和晚期個體。

作者利用糖尿病小鼠來確定HMGB1在改善DN發(fā)展中的作用。與20周的糖尿病小鼠相比，28周的糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)了嚴重的病理生理改變。隨著糖尿病的進展，腎臟組織損傷增加、膠原沉積和基底膜不規(guī)則增厚，表明糖尿病小鼠模型是可行的（圖7A）。與對照組相比，注射STZ后20和28周的小鼠血糖水平明顯升高（圖7B），最重要的是，其血清肌酐（圖7C）、尿素氮（圖7D）和尿微量白蛋白與肌酐比率（ACR；圖7E）水平（反映腎功能變化）隨著糖尿病的發(fā)生而逐漸升高。

隨著糖尿病小鼠腎臟組織的進展，HMGB1也顯示出顯著的上調。免疫熒光（圖7F）和蛋白質印跡分析（圖7G）顯示，患有腎損傷的糖尿病小鼠的腎臟組織具有較高水平的HMGB1，并且該水平隨著糖尿病持續(xù)時間的延長而增加。有趣的是，對照小鼠腎臟組織中HMGB1的表達隨著年齡的增長而增加，盡管統(tǒng)計上并不顯著（圖7G）。此外，建立了DN腎小管上皮細胞（HK2細胞）的體外模型。在高葡萄糖培養(yǎng)基（30mM）中對HK2細胞進行時間依賴性培養(yǎng)，隨著上皮-間質轉化(EMT)變化的加劇，36小時時HMGB1蛋白水平升高（圖7H）。通過免疫熒光觀察處理過的HK2細胞的HMGB1表達情況，結果顯示高糖刺激HK2細胞后，細胞核和細胞質中HMGB1的表達增加（圖7I）。數(shù)據(jù)表明HMGB1是一種新發(fā)現(xiàn)的標記物，可以將其作為監(jiān)測DN進展的潛在標記物進行評估。

作者通過定量蛋白質組學研究了糖尿病患者或不同階段的DN患者和健康對照者的蛋白質組，以了解DN進展過程中血清蛋白的變化。HMGB1、CD44、FBLN1、PTPRG和ADAMTSL4這五種有希望的生物標志物可以監(jiān)測DN的進展，而HMGB1與腎功能改變高度相關，可以作為早期檢測DN的合適標志物，尤其是區(qū)分健康對照者和DN患者。雖然沒有足夠的證據(jù)證明這些生物標志物可以取代DN的侵入性診斷，但隨著進一步研究，這些蛋白質組學變化可能有助于臨床醫(yī)生在早期識別DN。