1、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組的樣本

采用xCell算法評估CMV+UC患者的免疫微環(huán)境，進行WGCNA分析，獲得異常免疫細胞與基因水平或蛋白水平的共表達模塊，再利用隨機森林、SVM-rfe、Lasso三種機器學習方法篩選候選生物標志物，最后采用最佳子集選擇算法構建診斷模型。

1、CMV+IBD患者的免疫微環(huán)境與其他IBD患者不同

作者使用xCell算法評估了四個級別免疫細胞的豐度：CMV+UCvs.CMV-UC、CMV+UCvs.CMV+N、CMV-UCvs.CMV-N和CMV+Nvs.CMV-N。在CMV+UCvs.CMV-UC組中，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞、CD8+Tem、軟骨細胞、HSC、角質(zhì)形成細胞、肌細胞、神經(jīng)元、中性粒細胞、血小板和皮脂細胞的豐度異常（圖1A）。在CMV+UCvs.CMV+N組中，觀察到脂肪細胞、CD4+Tem、GMP、神經(jīng)元、中性粒細胞、血小板和Tgd細胞的水平異常（圖1B）。在CMV-UCvs.CMV-N組中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞、CD8+T細胞、ly內(nèi)皮細胞、系膜細胞、mv內(nèi)皮細胞、NKT、pDC和Tregs的水平異常（圖1C-D）。

2、識別CMV+UC特異性免疫微環(huán)境相關分子模塊

隨后對這四組進行了轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的差異分析，篩選差異表達基因（圖2A-B）以及通過GO和KEGG富集確定差異表達基因的功能。除此之外，還對四組中的異常免疫細胞、差異表達基因（DEG）和差異表達蛋白（DEP）進行了綜合分析，以確定CMV+UC患者特有的免疫細胞和生物標志物（圖2C-E）。接下來，使用WGCNA來識別CMV+UC患者特有的DEG和DEP的共表達模塊及其與免疫細胞的關聯(lián)（圖2F-G）。

3、構建免疫細胞相關分子調(diào)控網(wǎng)絡

進一步整合了同一異常免疫細胞內(nèi)的基因共表達模塊和蛋白質(zhì)共表達模塊，確定了潛在的調(diào)控關系。分析表明，CD4+Tem細胞僅與MEbrown(P)模塊相關；CD8+Tem細胞僅與MEyellow(P)模塊相關等（圖3A）。

進一步細化后，確定了四種潛在的調(diào)控關系：（I）MEgrey和MEgrey(P)：與軟骨細胞相關（圖3B）；（II）MEgreen、MEblue和MEyellow(P)：與中性粒細胞和Tgd細胞相關（圖3C）；（III）MEgreen、MEred、MEturquoise和MEturquoise(P)：與神經(jīng)元、中性粒細胞和血小板相關（圖3D）；（IV）MEgrey和MEblue(P)：與軟骨細胞相關（圖3E）。

隨后，構建了不同調(diào)控關系的基因共表達模塊和蛋白質(zhì)共表達模塊之間的共表達調(diào)控網(wǎng)絡。只有絕對相關系數(shù)大于0.5且p值小于0.05的調(diào)控關系才被認為是顯著的。這些調(diào)控網(wǎng)絡可能反映了異常的免疫微環(huán)境受到多種因素的影響（圖3B-E）。

4、使用機器學習算法識別CMV+UC的潛在診斷生物標志物

為了確定CMV+UC的早期診斷生物標志物，采用了五個層次的三種不同的機器學習算法：上面提到的四個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡和與異常免疫細胞相關的所有模塊。

考慮到所有模塊，隨機森林算法確定了25個具有分類功效的基因/蛋白質(zhì)（圖4M），SVM-RFE算法選擇了132個相關基因/蛋白質(zhì)（圖4N），LASSO算法確定了7個基因/蛋白質(zhì)（圖4O）

5、構建CMV+UC診斷模型

進一步整合了三種機器學習算法的結(jié)果。在所有模塊中，我們鑒定出55種在三種算法中均能持續(xù)表現(xiàn)出有效分類的分子（圖5A）。

隨后，整合了這些分子，得到了20個候選生物標志物，它們在不同水平上表現(xiàn)出穩(wěn)定的分類性能。使用最優(yōu)子集回歸，構建了CMV+UC的診斷模型。分析顯示，8個生物標志物模型實現(xiàn)了最大的R2和調(diào)整后的R2值，貝葉斯信息準則(BIC)最低(圖5B)。這些結(jié)果表明，8個生物標志物模型(表1)在診斷CMV+UC方面表現(xiàn)最佳(圖5C)。

本研究構建了CMV+IBD的高通量測序圖譜，數(shù)據(jù)顯示CMV+UC患者與其他患者相比具有獨特的免疫微環(huán)境，這些異常微環(huán)境與多個分子維度相關。這些分子有可能成為CMV+UC患者的診斷和治療標志物。雖然實時定量PCR檢測新鮮粘膜標本中的病毒載量是監(jiān)測IBD患者CMV感染的可行方法，但本研究的8分子模型為探索其他非侵入性診斷方法提供了新途徑。