研究背景

雖然GERD患者腸道菌群研究取得了一些進(jìn)展，但以往的研究大多集中于食管及胃內(nèi)的微生物。研究表明，正常人食管菌群主要由厚壁菌門(mén)中的革蘭氏陽(yáng)性菌鏈球菌組成，但研究發(fā)現(xiàn)GERD患者食管內(nèi)以擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和梭桿菌門(mén)中的革蘭氏陰性厭氧菌及微量需氧菌為主。此外，慢性炎癥已被證明在多種胃腸道疾?。ㄈ鏐E和食管癌）的發(fā)展中發(fā)揮作用，而慢性炎癥引起的腸道菌群改變則進(jìn)一步加速疾病的發(fā)生發(fā)展。革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分脂多糖（LPS）可能通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)來(lái)促進(jìn)組織炎癥。在動(dòng)物模型中，高脂飲食通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群上調(diào)IL-8/CXCL1炎癥信號(hào)通路促進(jìn)BE進(jìn)展為食管癌，證實(shí)了腸道菌群在疾病進(jìn)展中的作用。 GERD 患者腸道菌群的組成和功能仍不清楚，研究表明腸道菌群通過(guò)將宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為代謝物在維持胃腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。食管的正常功能通過(guò)能量代謝、黏膜屏障修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等多種機(jī)制維持。因此，腸道菌群失衡導(dǎo)致代謝物平衡被破壞可能促進(jìn) GERD 的發(fā)生。

研究思路

連續(xù)入組30例GERD患兒和30例健康對(duì)照（HC），收集受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征。首先采用16S rRNA測(cè)序評(píng)估GERD組和HC組患兒腸道菌群的差異，選取10例GERD患兒和10例HC組患兒進(jìn)行宏基因組學(xué)分析。采用液相色譜/質(zhì)譜法（LC/MS）進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，并將宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)分析。

主要結(jié)果

作者使用 16S rDNA 測(cè)序檢測(cè) GERD 兒童和 HC 兒童的糞便微生物。α多樣性結(jié)果顯示，GERD患兒的Shannon和Simpson指數(shù)顯著低于HC組（圖 1B、C），ANOSIM分析表明，兩組微生物群落結(jié)構(gòu)分布存在顯著差異（圖 1D），PCoA和NMDS顯示兩組腸道微生物組成存在差異（圖 1E、F）。門(mén)水平上，GERD組變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于HC組，而厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度顯著低于HC組（圖 1G）；在科水平上，GERD患兒腸桿菌科、擬桿菌科和普雷沃氏菌科相對(duì)豐度較高，雙歧桿菌科、瘤胃球菌科和毛螺菌科相對(duì)豐度較低（圖 1H）；屬水平上， GERD組患兒擬桿菌屬、普氏菌屬-9型、大腸桿菌-志賀菌屬、克雷伯菌屬和嗜血桿菌屬的相對(duì)豐度均顯著高于HC組患兒，而雙歧桿菌屬、糞桿菌屬和鏈球菌屬的相對(duì)豐度在GERD組低于HC組（圖 1I)。LEfSe分析顯示， GERD組中Prevotella-9和Bacteroides豐度最高，而HC組中Bifidobacterium和Blautia豐度最高(圖 1J、K）。

為了從物種水平上了解GERD患兒腸道菌群的變化，作者還進(jìn)行了宏基因組測(cè)序。 PCoA 結(jié)果顯示，GERD 組和 HC 組在物種水平上的微生物組成存在明顯分離（圖 2B)，ANOSIM證實(shí)了兩組腸道菌群組成在物種水平上存在顯著差異(圖 2C）。Bacteroides stercoris、Bacteroides vulgatus、Alistipes putredinis、Bacteroides dorei、Bacteroides fragilis的豐度顯著增加，而Fusicatenibacter saccharivorans、Blautia wexlerae、 Blautia obeum、Anaerostipes hadrus、Eubacterium hallii的豐度顯著降低（圖 2E、F）。

為明確GERD患兒腸道菌群的功能特征，本研究利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步注釋了腸道菌群宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)，ANOSIM分析顯示，在KEGG直系親屬（KO）水平上，GERD組與HC組腸道菌群存在顯著差異（圖 3A）。PCoA結(jié)果證實(shí)GERD組與HC組之間基于KEGG模塊的微生物功能分布存在顯著差異（圖 3B），GERD組能量、氨基酸、維生素、碳水化合物、脂質(zhì)等代謝途徑活性低于HC組，而糖類(lèi)合成及代謝途徑活性高于HC組（圖 3C-E）。

本研究還利用LC/MS技術(shù)對(duì)兩組患兒血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析。PLS-DA結(jié)果顯示GERD組與HC組血清樣本代謝特征存在明顯差異（圖 4A–D）。進(jìn)一步用火山圖分析兩組間的差異代謝物，閾值設(shè)定為VIP>1.0、FC>1.5或FC<0.667，P值<0.05。

進(jìn)一步對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)富集排名前三的通路為全局及概覽圖、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝（圖 5C）。GERD患兒與HC患兒代謝物差異影響的代謝通路主要包括花生四烯酸（AA）代謝、酪氨酸代謝、硫代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、咖啡因代謝（圖 5D）。

采用Pearson相關(guān)性分析方法分析GERD患兒腸道差異微生物與血清代謝物的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示GERD患兒血清代謝物的變化與腸道菌群中多種細(xì)菌水平的變化呈顯著相關(guān)性，其中軟骨霉菌（Chondromyces）、Labilithrix和Stigmatella的水平與多種代謝物水平呈顯著正相關(guān)（圖 6），表明腸道菌群和代謝物之間存在顯著的相互作用，可能影響GERD的發(fā)生。

文章小結(jié)

本研究不僅揭示了GERD患兒腸道菌群失衡的現(xiàn)象，還揭示了GERD患兒腸道菌群中特定核心菌群的失衡及其功能變化，并進(jìn)一步分析了腸道菌群與代謝物變化之間的關(guān)系，這些結(jié)果不僅為GERD相關(guān)腸道菌群失衡的假說(shuō)提供了直接證據(jù)，也可能為進(jìn)一步研究GERD的發(fā)病機(jī)制提供有力證據(jù)。