1、正常和纖維化肺組織中 AT2 細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

為了研究人類 IPF 肺組織內(nèi) AT2 細(xì)胞的異質(zhì)性，作者收集并分析了 IPF 患者和正常對(duì)照的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，確定了 12 個(gè)主要細(xì)胞群，包括巨噬細(xì)胞、NK/T 細(xì)胞、AT2 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)、內(nèi)皮細(xì)胞、棒狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、基底細(xì)胞和 AT1 細(xì)胞（圖 2A-B)。隨后檢查了 IPF 和正常組織之間的細(xì)胞組成變化（圖 2C)。此外，還對(duì)每個(gè)細(xì)胞群的差異表達(dá)基因 (DEG) 進(jìn)行了分析（圖 2D)。

然后作者又對(duì)AT2 細(xì)胞進(jìn)行再分層和注釋，將 AT2 細(xì)胞分為 11 個(gè)假定細(xì)胞群（圖 3A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，纖維化肺組織中 AT2 細(xì)胞簇 10 和 11 顯著增加，將其定義為 IPF 相關(guān) AT2 (IR_AT2) 簇（圖 3A-B 和圖 S1）。這一發(fā)現(xiàn)表明這些特定細(xì)胞群在纖維化中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

為了進(jìn)一步探討IPF相關(guān)AT2細(xì)胞參與肺纖維化發(fā)展的潛在分子機(jī)制，作者對(duì)IPF相關(guān)AT2細(xì)胞中高表達(dá)的特征基因進(jìn)行了功能富集分析。結(jié)果顯示HIF1和IL17信號(hào)通路、細(xì)胞衰老和IR_AT2簇1之間存在顯著關(guān)聯(lián)，而IR_AT2簇2的特征基因在p53和hedgehog信號(hào)通路以及細(xì)胞周期中顯著富集（圖3D-F)。此外，轉(zhuǎn)錄因子分析表明，IR_AT2 簇 1 和 IR_AT2 簇 2 中的轉(zhuǎn)錄因子KLF5和MYC分別被顯著激活（圖 3G）。

2、擬時(shí)間軌跡分析與細(xì)胞通訊分析

為了研究 IR_AT2 細(xì)胞在 IPF 發(fā)展中的起源，對(duì) AT2 細(xì)胞進(jìn)行了擬時(shí)序軌跡分析，該分析揭示了 IR_AT2 細(xì)胞在發(fā)育軌跡中的獨(dú)特位置（圖4A-C）。 

為了系統(tǒng)地研究各種 AT2 細(xì)胞亞群的細(xì)胞間相互作用，作者進(jìn)行了細(xì)胞通訊分析。該分析表明，IR_AT2 細(xì)胞表現(xiàn)出與參與 IPF 發(fā)病機(jī)制的其他細(xì)胞亞型的強(qiáng)大通信能力（圖 4D). IR_AT2 簇 1 和 IR_AT2 簇 2 均表現(xiàn)出更強(qiáng)的分泌能力（圖4E)。 另外，研究發(fā)現(xiàn)，IR_AT2 簇可以通過粘附配體-受體對(duì)（如 MIF/CD74/CD44、GDF5/TGFBR2 和 GAS6/AXL）直接與其他 AT2 細(xì)胞亞型相互作用（圖 4F、G）。此外，在 IR_AT2 細(xì)胞與其他細(xì)胞亞型之間的通訊中，促炎信號(hào)通路（包括 MIF、GDF 和 GAS）上調(diào)（圖 4H-J 和圖 S2）。

3、通過 hdWGCNA 識(shí)別與 IPF 相關(guān)的 AT2 相關(guān)的關(guān)鍵模塊

作者利用高維加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (hdWGCNA)來檢查 IR_AT2 細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵模塊。該分析揭示了 12 個(gè)不同的基因共表達(dá)模塊（圖5B-C 和圖S3）。值得注意的是，黃色、綠黃色、藍(lán)色和紫色模塊主要在 IR_AT2 細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出高水平的激活（圖 5D)。 此外，作者還探討了模塊之間的相關(guān)性（圖 5E-F)。

4、各種機(jī)器學(xué)習(xí)算法識(shí)別 IPF 相關(guān) AT2 細(xì)胞的特征基因

基于hdWGCNA篩選結(jié)果，進(jìn)一步利用外部數(shù)據(jù)集（GSE70866）采用三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法識(shí)別與IPF相關(guān)AT2細(xì)胞相關(guān)的樞紐基因。LASSO回歸算法確定了與IPF患者預(yù)后顯著相關(guān)的10個(gè)關(guān)鍵基因（圖 6A-B）。隨機(jī)森林分析按重要性對(duì)所有基因進(jìn)行排序，并突出顯示前 30 個(gè)基因（圖 6C-D）。 此外，Xgboost算法篩選出了10個(gè)關(guān)鍵基因（圖 6E). 最后確定了三個(gè)關(guān)鍵基因：IER3、KRT18和RAB25。

5、基于機(jī)器學(xué)習(xí)的特發(fā)性肺纖維化預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

為了更深入地了解 IR_AT2 細(xì)胞基因特征與纖維化之間的相關(guān)性，首先分析了正常和纖維化肺組織中與 IPF 相關(guān) AT2 細(xì)胞 (IARG) 相關(guān)的基因評(píng)分。研究結(jié)果顯示 IPF 肺組織中的 IARG 評(píng)分顯著增加，表明這些基因與纖維化過程之間存在潛在相關(guān)性 (圖6G）。

然后，作者基于已識(shí)別的 IARG 特征構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型來預(yù)測(cè) IPF 的發(fā)病和進(jìn)展。首先，進(jìn)行了ROC曲線分析，以評(píng)估已識(shí)別的樞紐基因的診斷性能。結(jié)果顯示，IER3、KRT18、RAB25和整體 IARG 評(píng)分均表現(xiàn)出高于 0.65 的 AUC 值，表明這三個(gè)基因特征可有效區(qū)分 IPF 患者（圖7A-B)。此外，IPF 患者中這三種基因水平升高和 IARG 評(píng)分較高與生存時(shí)間較短相關(guān)（圖7C-D）。肺一氧化碳擴(kuò)散能力預(yù)測(cè)百分比 (% DLCO) 與 IARG 評(píng)分升高之間始終存在負(fù)相關(guān)性 (相關(guān)系數(shù) = ?0.44，p值 < 0.05)，如圖所示圖 7E。

最后，應(yīng)用七種機(jī)器學(xué)習(xí)算法并優(yōu)化每個(gè)模型的參數(shù)，然后重復(fù)五次十倍交叉驗(yàn)證。使用GSE110147數(shù)據(jù)集進(jìn)行訓(xùn)練，使用GSE32537數(shù)據(jù)集評(píng)估最終模型的預(yù)測(cè)能力。通過評(píng)估兩個(gè)模型的 AUC 值，最終選擇了“svm”機(jī)器學(xué)習(xí)算法模型（圖 7G-H）。